1) Colocar a máscara
cirúrgica (utilizada para evitar que contaminantes sejam introduzidos
devido à
movimentação do ar gerado pela respiração
do operador ) e desinfetar a bancada de trabalho e as mãos
com álcool (cuidado!).
2) Aguardar que o álcool
evapore para acender o bico de Bunsen (CLIQUE
AQUI) .A função da chama de gás é produzir
uma área estéril em sua proximidade e portanto
quando se trabalha com os materiais próximos à mesma
, tem-se assegurada a transferência de micélio
sem introdução de contaminantes carregados
pelo ar , porém o restante do material que vai entrar
em contato com o meio de cultura também já deverá estar
esterilizado . A chama também é utilizada
para esterilizar todos os materiais metálicos (hastes,
etc) que irão entrar
em contato com o micélio. No texto seguinte os tubos
receberam uma numeração diferenciadora (1 e 2) para auxiliar
o entendimento do procedimento de repique da cultura do
tubo 1 (cultura inicial) para o tubo 2 (cultura filha).
3) Segurar o cabo
da haste metálica com o indicador e o
polegar da mão direita e passar a haste
na chama do bico de Bunsen até ficar avermelhada
(importante : esterilizar toda a extensão
da haste, menos o cabo, obviamente ). O comprimento
da haste deve ser tal que permita alcançar
o fundo do tubo com folga, impedindo que o cabo
venha a tocar a boca do tubo, pois o cabo não
foi esterilizado na chama. Deixar a haste esfriar
(cerca de 15-20 segundos) apoiada somente pelo
cabo no suporte próximo à chama
, porém fora da mesma. Não tocar
em nada com a haste que foi esterilizada.Sempre
apoiar a haste esterilizada no suporte apenas
pelo cabo.
4) Segurar
a tampa do tubo de
cultura 1 com o dedo
mínimo
da mão direita
e abri-lo girando-o
com a
mão
esquerda. (CLIQUE
AQUI) (cuidado
para não tocar na parte interna da tampa com o dedo mínimo)
5) Passar
a boca do tubo 1 na
chama do bico de Bunsen
(flambagem)
por alguns segundos
para esterilizá-la,
mantendo sempre a boca
do tubo inclinada
para cima e num ângulo
aproximado de 30º .Não
trabalhar com a boca
do tubo na vertical
para reduzir
o risco de contaminações
pelo ar. Não
tocar na boca do tubo
com
os
dedos, após
a flambagem , pois
além de estar
quente
, poderá contaminar
o interior do tubo.
6) Ainda
segurando a tampa do
tubo com o dedo mínimo
da mão direita,
pegar a haste metálica
do suporte e introduzi-la
dentro
do tubo 1 (tomando-se
o cuidado de não
encostar a haste em
nenhum local a não
ser no interior do
tubo para
não causar
uma contaminação do
micélio) pegando um
pequeno pedaço
do micélio crescido
na superfície do ágar
juntamente com um
pouco do ágar.(CLIQUE
AQUI). Observar
que a tampa do tubo
continua sendo segura
pelo dedo mínimo. Segurar
a haste com o micélio
aderido próximo à chama
do bico de Bunsen (para
evitar contaminação) ,
porém
não sobre ela
(o micélio morrerá pelo
calor da chama).
7) Flambar
a boca do tubo 1
novamente na chama
do bico
de Bunsen , fechá-lo
com a tampa rosqueada
(tocando
a boca do tubo somente
com a parte interna
da tampa rosqueada
) e colocá-lo
na estante.
8) Pegar
outro tubo de ensaio
(tubo 2) com meio
recém
preparado e abri-lo,
segurando a tampa
com o dedo mínimo
da mão
direita , flambar
a boca deste tubo
(2) na
chama
do
bico de Bunsen e
transferir para o
seu interior o pedaço
de micélio
coletado com a haste,
colocando-o
na porção
média da superfície
do meio de cultura
novo. Durante a transferência
, não tocar
na parte externa
do
tubo
com
a haste ou com o
micélio.
Se isto ocorrer,
desprezar esse pedaço
de micélio
e esterilizar a haste
na chama do bico
de Bunsen, até avermelhar
e reiniciar todo
o processo com um
outro
pedaço de
micélio preso
ao ágar.
9) Flambar
a boca desse
tubo (2) no bico
de Bunsen, fechá-lo
com a tampa rosqueada
(tocando a boca do
tubo somente com
a parte interna da
tampa
rosqueada ) e
anotar nesse tubo
os dados do cogumelo
e
a data de inoculação
, colocando-o na
estante. Armazenar
em local
limpo, isento de
poeira e com
temperatura ambiente
em torno de 25ºC
para promover o crescimento
do micélio
recém
transplantado para
o novo meio de cultura
(tubo 2). Deve-se
observar diariamente
o desenvolvimento
do micélio
nos tubos que deverá ter
aspecto branco e
livre de pontos coloridos
(verde,azul,etc).
Micélio
com cores diferentes
do branco indicam
a presença
de contaminantes.
Qualquer tubo que
apresentar
problemas de contaminação
deve ter seu conteúdo
descartado e o tubo
lavado para ser reaproveitado.
Se a superfície
do ágar
apresenta um escorrimento
leitoso a partir
do local onde o micélio
foi inoculado,
isto
indica
a presença
de bactérias
e o material deverá ser
descartado. Esse
aspecto leitoso
já pode ser
visível
dentro de 24 horas
após a
inoculação.
10) A
etapa de transferência
descrita acima será melhor
realizada por duas pessoas
pois dessa forma fica facilitado
e agilizado o manuseio
dos tubos e da haste metálica.
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